Проточная цитометрия: преимущества метода и область применения

Количественная цитометрия – относительно новая методика микробиологического исследования дисперсионных сред, проводимая с помощью специального оборудования. Цитометрия бывает статической и проточной.

Статическая цитометрия проводится с использованием конфокальных микроскопов; при их отсутствии в ход идут слегка модифицированные люминесцентные микроскопы, оснащенные простыми и дешевыми системами анализа изображений.

Проточная цитометрия осуществляется на специальных аппаратах – сортерах и проточных цитрометрах.

Оба варианта количественной цитометрии имеют широчайшие возможности применения в практике медицинских и биологических исследований. Несмотря на разность используемого клинического материала и экспериментальных моделей решаемые ими задачи подчиняются общим принципам исследования.

Что такое проточная цитометрия?

Проточной цитометрией называют методику исследования дисперсионных субстанций в режиме поштучного анализа частиц, входящих в состав дисперсной фазы по сигналам, получаемым в ходе флуоресценции и рассеивания света.

Методика проточной цитометрии была создана на базе специальных экспериментов по определению размера исследуемых частиц и подсчету их количества.

Первый клеточный сортер был создан в 1965 году, а с начала следующего десятилетия был налажен выпуск приборов, предназначенных для измерения интенсивности флуоресценции при нескольких длинах волн с целью определения сразу нескольких параметров изучаемых клеток.

Современные исследователи для осуществления проточной цитометрии используют приборы двух типов:

  • Приборы, предназначенные для измерения флуоресценции при двух (и более) длинах волн и рассеивании света под углом в десять (так называемом малоугловом прямом рассеивании) и девяносто градусов. Приборы этого типа отличаются простотой использования.
  • Довольно громоздкие клеточные сортеры, способные измерить более пяти параметров исследуемых ядер или частиц, а также отсортировать клетки, обладающие определенным набором параметров.

Устройство современных проточных цитометров настолько сложно и разнообразно, что с трудом поддается какому-либо обобщению и систематизации, однако несколько общих моментов, характерных для всех приборов, все же существует:

  • Для проведения анализа на цитометре любого типа требуется гомогенная суспензия клеток определенного типа.
  • Не должно быть недостатка в количестве исследуемых клеток или их ядер.
  • Чтобы не допустить слипания клеток, исследователь должен обладать всей полнотой информации о характере рассеивания света и иметь под рукой таблицы с соответствующими данными.

Образцы

Образцы исследования проточной цитометрииВ ходе медицинских и биологических исследований изучаются образцы, приготовленные из клеток:

  • костного мозга;
  • крови;
  • спинномозговой жидкости (ликвора);
  • синовиальной (суставной) жидкости;
  • плевральной жидкости;
  • перитонеальной (асцитической) жидкости, накапливающейся в брюшной полости в процессе развития асцита;
  • опухолевых и здоровых тканей.

Принцип метода проточной цитометрии

Принципы, заложенные в основу процедуры цитометрии, чрезвычайно просты.

Суспензия, приготовленная из клеток, предварительно помеченных флуоресцирующими моноклональными антителами или флуорохромами, помещается в поток дисперсионной среды, пропускаемый через проточную ячейку.

Гидродинамическое фокусирование струи клеточной суспензии в струе дисперсионной среды приводит к тому, что исследуемые клетки или их ядра выстраиваются поодиночке и в таком порядке пересекают пучок сфокусированных световых (обычно лазерных) лучей.

Свет, исходящий от флуорохромов, фокусируют при помощи оптической системы, состоящей из нескольких зеркал и линз, а затем раскладывают на определенные компоненты.

Полученные световые сигналы подвергают анализу и преобразованию в электрические импульсы, а затем – в определенные формы, приемлемые для компьютерной обработки и хранения полученной информации.

Флуорохромы

Для того чтобы облегчить процесс определения клеточных структур в ходе процедуры проточной цитометрии, используемую дисперсионную среду подкрашивают специальными флуоресцирующими красителями – флуорохромами.

После такой обработки исследуемые клетки приобретают способность флуоресцировать (светиться) под воздействием пучка световых лучей.

При выборе того или иного красителя пользуются целым рядом критериев:

  • Используемый флуорохром должен быть специфичным по отношению к исследуемой ДНК.
  • Спектральные характеристики красителя должны соответствовать возможностям используемой аппаратуры.
  • Немаловажным фактором является стоимость флуорохрома (она не должна быть очень высокой).
  • Используемые красители должны быть удобны в работе (обладать стабильностью и хорошей растворимостью).

Одним из самых востребованных флуорохромов является йодистый пропидий: его спектральные характеристики идеально подходят для выполнения проточной цитометрии.

Чтобы активизировать флуоресценцию, используя йодистый пропидий, исследователи прибегают к помощи обычного аргонового лазера (рабочая длина его волны составляет 480 нм). Площадь флуоресцирующего участка такова, что позволяет использовать вышеозначенный флуорохром для выполнения многопараметрических измерений.

Для проведения проточной цитометрии также используют:

  • изотиоцианат флуоресцеина;
  • фикоэритрины (Су5, Су7, техасский красный);
  • аллофикоцианин;
  • Перидинин-Хлорофилл Протеин.

Вне зависимости от того, какой именно краситель принимает участие в процедуре, его количество должно быть прямо пропорционально содержанию ДНК в структуре клетки.

Чтобы добиться качественного прокрашивания всех клеточных структур, количество применяемого флуорохрома должно быть избыточным.

Большинство флуорохромов, вступающих в контакт с ДНК, не способно пройти сквозь мембраны неповрежденных (интактных) клеток. Для повышения проницаемости клеточных мембран исследуемые клетки обрабатывают поверхностно-активными веществами (детергентами) или спиртом.

Преимущества

Преимущества проточной цитометрииНесомненными преимуществами проточной цитометрии можно считать:

  • Высокую (до ста тысяч эпизодов в секунду) скорость выполнения анализа.
  • Возможность определения клеточных субпопуляций.
  • Способность выполнить анализ огромного (до 108 элементов в одном мл дисперсионной среды) количества клеток.
  • Возможность определения параметров любых клеток и клеточных структур (в том числе и редко встречающихся).
  • Высокую степень объективности в измерении интенсивности свечения (флуоресценции).

Где применяется?

Спектр применения проточной цитометрии необыкновенно широк. Она применяется даже в индустрии, для контроля производственного процесса. Продемонстрируем это, для наглядности представив информацию в виде списков.

В онкологии

В этом разделе медицины проточную цитометрию применяют с целью:

  • количественного анализа внутриклеточных структур (ДНК);
  • исследования основных параметров клеточного цикла;
  • идентификации и подсчета клеток, относящихся к разным периодам клеточного цикла;
  • обнаружения анеуплоидных клонов (аномальных клеток с нестандартным набором хромосом), свидетельствующих о развитии острого лейкоза;
  • выявления степени пролиферативной активности (тенденции к активному делению) анеуплоидных клонов;
  • обнаружения опухолевых маркеров;
  • наблюдения за состоянием пациентов, находящихся в группе риска;
  • оценки функционирования иммунной системы и функциональной состоятельности иммунных клеток;
  • выявления субпопуляций лимфоцитов (эта характеристика позволяет оценить состояние иммунитета).

Видео о методе проточной цитометрии в диагностике острых лейкозов:

Иммунологии

Метод проточной цитометрии позволяет:

  • осуществить иммунофенотипирование (определить тип и функциональное состояние) клеток крови;
  • установить фагоцитарную активность иммунных клеток (об этом свидетельствует захват бактерий, помеченных флуоресцирующими красителями);
  • идентифицировать внутриклеточные белки;
  • определить степень пролиферативной активности;
  • исследовать стадии клеточного цикла;
  • оценить степень цитотоксичности (защитного механизма, позволяющего на внутриклеточном уровне уничтожать простейшие организмы, бактерии и вирусы) клеток.

Цитологии

Проточная цитометрия дает исчерпывающие данные, позволяющие:

  • безошибочно установить цитоморфологические характеристики любой клетки (ее размеры, уровень асимметричности, соотношение между ядром и цитоплазмой);
  • оценить активность ферментов, входящих в состав клетки;
  • проанализировать стадии клеточного цикла;
  • измерить физиологические внутриклеточные параметры (уровень pH, потенциал клеточной мембраны, концентрацию свободных ионов).

Гематологии

С помощью проточной цитометрии гематологи могут:

  • проанализировать субпопуляционный состав кровяных клеток;
  • подсчитать количество ретикулоцитов и тромбоцитов с помощью специфических маркеров;
  • оценить последствия резидуальной (остаточной, не до конца излеченной) болезни;
  • диагностировать острый лейкоз;
  • выполнить дифференциальную диагностику реактивного лимфоцитоза и лимфопролиферативных болезней (недугов, при которых поражаются клетки, имеющие лимфоидную природу);
  • осуществить диагностику заболеваний лимфопролиферативной этиологии.

Фармакологии

Проточная цитометрия помогает фармакологам:

  • установить уровень экспрессии (чувствительности опухолей разных локализаций к лечению лекарственными препаратами) белковых маркеров;
  • измерить активность ферментов, входящих в состав клеток;
  • занимающимся изучением действия биоактивных веществ на состояние клеток человеческого организма, определить любую стадию клеточного цикла.

Сельском хозяйстве

Метод проточной цитометрии активно используется учеными, специализирующимися на селекции новых видов растений и выведении пород домашнего скота, поскольку она позволяет:

  • определить плоидность (количество одинаковых хромосомных наборов в ядрах) клеток;
  • произвести анализ любой стадии клеточного цикла;
  • выполнить анализ содержимого протопластов (бактериальных или растительных клеток), а также произвести их сортировку в соответствии с заданными параметрами.

Понравилась статья? Поделитесь с друзьями в социальных сетях:

И подписывайтесь на обновления сайта в Контакте, Одноклассниках, Facebook, Google Plus, Twitter или по RSS.

loading...

Оставить комментарий

Ваш адрес электронной почты не будет опубликован.