Количественная цитометрия – относительно новая методика микробиологического исследования дисперсионных сред, проводимая с помощью специального оборудования. Цитометрия бывает статической и проточной.
Статическая цитометрия проводится с использованием конфокальных микроскопов; при их отсутствии в ход идут слегка модифицированные люминесцентные микроскопы, оснащенные простыми и дешевыми системами анализа изображений.
Проточная цитометрия осуществляется на специальных аппаратах – сортерах и проточных цитрометрах.
Оба варианта количественной цитометрии имеют широчайшие возможности применения в практике медицинских и биологических исследований. Несмотря на разность используемого клинического материала и экспериментальных моделей решаемые ими задачи подчиняются общим принципам исследования.
Содержание
Что такое проточная цитометрия?
Проточной цитометрией называют методику исследования дисперсионных субстанций в режиме поштучного анализа частиц, входящих в состав дисперсной фазы по сигналам, получаемым в ходе флуоресценции и рассеивания света.
Методика проточной цитометрии была создана на базе специальных экспериментов по определению размера исследуемых частиц и подсчету их количества.
Первый клеточный сортер был создан в 1965 году, а с начала следующего десятилетия был налажен выпуск приборов, предназначенных для измерения интенсивности флуоресценции при нескольких длинах волн с целью определения сразу нескольких параметров изучаемых клеток.
Современные исследователи для осуществления проточной цитометрии используют приборы двух типов:
- Приборы, предназначенные для измерения флуоресценции при двух (и более) длинах волн и рассеивании света под углом в десять (так называемом малоугловом прямом рассеивании) и девяносто градусов. Приборы этого типа отличаются простотой использования.
- Довольно громоздкие клеточные сортеры, способные измерить более пяти параметров исследуемых ядер или частиц, а также отсортировать клетки, обладающие определенным набором параметров.
Устройство современных проточных цитометров настолько сложно и разнообразно, что с трудом поддается какому-либо обобщению и систематизации, однако несколько общих моментов, характерных для всех приборов, все же существует:
- Для проведения анализа на цитометре любого типа требуется гомогенная суспензия клеток определенного типа.
- Не должно быть недостатка в количестве исследуемых клеток или их ядер.
- Чтобы не допустить слипания клеток, исследователь должен обладать всей полнотой информации о характере рассеивания света и иметь под рукой таблицы с соответствующими данными.
Образцы
В ходе медицинских и биологических исследований изучаются образцы, приготовленные из клеток:
- костного мозга;
- крови;
- спинномозговой жидкости (ликвора);
- синовиальной (суставной) жидкости;
- плевральной жидкости;
- перитонеальной (асцитической) жидкости, накапливающейся в брюшной полости в процессе развития асцита;
- опухолевых и здоровых тканей.
Принцип метода проточной цитометрии
Принципы, заложенные в основу процедуры цитометрии, чрезвычайно просты.
Суспензия, приготовленная из клеток, предварительно помеченных флуоресцирующими моноклональными антителами или флуорохромами, помещается в поток дисперсионной среды, пропускаемый через проточную ячейку.
Гидродинамическое фокусирование струи клеточной суспензии в струе дисперсионной среды приводит к тому, что исследуемые клетки или их ядра выстраиваются поодиночке и в таком порядке пересекают пучок сфокусированных световых (обычно лазерных) лучей.
Свет, исходящий от флуорохромов, фокусируют при помощи оптической системы, состоящей из нескольких зеркал и линз, а затем раскладывают на определенные компоненты.
Полученные световые сигналы подвергают анализу и преобразованию в электрические импульсы, а затем – в определенные формы, приемлемые для компьютерной обработки и хранения полученной информации.
Флуорохромы
Для того чтобы облегчить процесс определения клеточных структур в ходе процедуры проточной цитометрии, используемую дисперсионную среду подкрашивают специальными флуоресцирующими красителями – флуорохромами.
После такой обработки исследуемые клетки приобретают способность флуоресцировать (светиться) под воздействием пучка световых лучей.
При выборе того или иного красителя пользуются целым рядом критериев:
- Используемый флуорохром должен быть специфичным по отношению к исследуемой ДНК.
- Спектральные характеристики красителя должны соответствовать возможностям используемой аппаратуры.
- Немаловажным фактором является стоимость флуорохрома (она не должна быть очень высокой).
- Используемые красители должны быть удобны в работе (обладать стабильностью и хорошей растворимостью).
Одним из самых востребованных флуорохромов является йодистый пропидий: его спектральные характеристики идеально подходят для выполнения проточной цитометрии.
Чтобы активизировать флуоресценцию, используя йодистый пропидий, исследователи прибегают к помощи обычного аргонового лазера (рабочая длина его волны составляет 480 нм). Площадь флуоресцирующего участка такова, что позволяет использовать вышеозначенный флуорохром для выполнения многопараметрических измерений.
Для проведения проточной цитометрии также используют:
- изотиоцианат флуоресцеина;
- фикоэритрины (Су5, Су7, техасский красный);
- аллофикоцианин;
- Перидинин-Хлорофилл Протеин.
Вне зависимости от того, какой именно краситель принимает участие в процедуре, его количество должно быть прямо пропорционально содержанию ДНК в структуре клетки.
Чтобы добиться качественного прокрашивания всех клеточных структур, количество применяемого флуорохрома должно быть избыточным.
Большинство флуорохромов, вступающих в контакт с ДНК, не способно пройти сквозь мембраны неповрежденных (интактных) клеток. Для повышения проницаемости клеточных мембран исследуемые клетки обрабатывают поверхностно-активными веществами (детергентами) или спиртом.
Преимущества
Несомненными преимуществами проточной цитометрии можно считать:
- Высокую (до ста тысяч эпизодов в секунду) скорость выполнения анализа.
- Возможность определения клеточных субпопуляций.
- Способность выполнить анализ огромного (до 108 элементов в одном мл дисперсионной среды) количества клеток.
- Возможность определения параметров любых клеток и клеточных структур (в том числе и редко встречающихся).
- Высокую степень объективности в измерении интенсивности свечения (флуоресценции).
Где применяется?
Спектр применения проточной цитометрии необыкновенно широк. Она применяется даже в индустрии, для контроля производственного процесса. Продемонстрируем это, для наглядности представив информацию в виде списков.
В онкологии
В этом разделе медицины проточную цитометрию применяют с целью:
- количественного анализа внутриклеточных структур (ДНК);
- исследования основных параметров клеточного цикла;
- идентификации и подсчета клеток, относящихся к разным периодам клеточного цикла;
- обнаружения анеуплоидных клонов (аномальных клеток с нестандартным набором хромосом), свидетельствующих о развитии острого лейкоза;
- выявления степени пролиферативной активности (тенденции к активному делению) анеуплоидных клонов;
- обнаружения опухолевых маркеров;
- наблюдения за состоянием пациентов, находящихся в группе риска;
- оценки функционирования иммунной системы и функциональной состоятельности иммунных клеток;
- выявления субпопуляций лимфоцитов (эта характеристика позволяет оценить состояние иммунитета).
Видео о методе проточной цитометрии в диагностике острых лейкозов:
Иммунологии
Метод проточной цитометрии позволяет:
- осуществить иммунофенотипирование (определить тип и функциональное состояние) клеток крови;
- установить фагоцитарную активность иммунных клеток (об этом свидетельствует захват бактерий, помеченных флуоресцирующими красителями);
- идентифицировать внутриклеточные белки;
- определить степень пролиферативной активности;
- исследовать стадии клеточного цикла;
- оценить степень цитотоксичности (защитного механизма, позволяющего на внутриклеточном уровне уничтожать простейшие организмы, бактерии и вирусы) клеток.
Цитологии
Проточная цитометрия дает исчерпывающие данные, позволяющие:
- безошибочно установить цитоморфологические характеристики любой клетки (ее размеры, уровень асимметричности, соотношение между ядром и цитоплазмой);
- оценить активность ферментов, входящих в состав клетки;
- проанализировать стадии клеточного цикла;
- измерить физиологические внутриклеточные параметры (уровень pH, потенциал клеточной мембраны, концентрацию свободных ионов).
Гематологии
С помощью проточной цитометрии гематологи могут:
- проанализировать субпопуляционный состав кровяных клеток;
- подсчитать количество ретикулоцитов и тромбоцитов с помощью специфических маркеров;
- оценить последствия резидуальной (остаточной, не до конца излеченной) болезни;
- диагностировать острый лейкоз;
- выполнить дифференциальную диагностику реактивного лимфоцитоза и лимфопролиферативных болезней (недугов, при которых поражаются клетки, имеющие лимфоидную природу);
- осуществить диагностику заболеваний лимфопролиферативной этиологии.
Фармакологии
Проточная цитометрия помогает фармакологам:
- установить уровень экспрессии (чувствительности опухолей разных локализаций к лечению лекарственными препаратами) белковых маркеров;
- измерить активность ферментов, входящих в состав клеток;
- занимающимся изучением действия биоактивных веществ на состояние клеток человеческого организма, определить любую стадию клеточного цикла.
Сельском хозяйстве
Метод проточной цитометрии активно используется учеными, специализирующимися на селекции новых видов растений и выведении пород домашнего скота, поскольку она позволяет:
- определить плоидность (количество одинаковых хромосомных наборов в ядрах) клеток;
- произвести анализ любой стадии клеточного цикла;
- выполнить анализ содержимого протопластов (бактериальных или растительных клеток), а также произвести их сортировку в соответствии с заданными параметрами.